Sievers Eclipse细菌内毒素检测：克服抑制/增强干扰的操作程序

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背景

革兰氏阴性菌（GNB）给全球公共卫生造成了最严重的问题之一，因为这种细菌对抗生素有高度耐药性¹，而且会引发肺炎、血液感染、伤口和手术部位感染、脑膜炎等感染性疾病²。细菌内毒素是GNB细胞膜的关键成分，当浓度足够高时会引发致热反应（即高烧）。美国食品药品监督管理局（FDA）要求制药厂进行细菌内毒素检测（BET，Bacterial Endotoxins Testing），重点测量注射用水（WFI，Water For Injection）、制药原材料、成品药、医疗器械等所有涉及注射用药物的GNB污染程度。细菌内毒素的检测方法主要有以下3种：1、凝胶法（Gel-Clot），2、动态浊度法（KTA，Kinetic Turbidimetric Assay），3、动态显色法（KCA，Kinetic Chromogenic Assay）。

鲎试剂（LAL，Limulus Amebocyte Lysate）提取自鲎的血液，用于细菌内毒素检测。当检测到内毒素时，鲎试剂级联就会有一系列酶促反应，酶促反应会放大内毒素的显现。当内毒素与鲎试剂反应时，内毒素会激活酶级联中的第一个因子 — C因子，然后C因子会激活B因子。B因子会作用于凝固酶原，使其成为凝固酶。最后的检测步骤就是凝固（用凝胶法）、浊度（用动态浊度法）或显色（用动态显色法）。下图1是采用动态显色法时鲎试剂级联反应的示意图。

图 1：采用动态显色法的鲎试剂级联反应

LPS：Lipopolysaccharide，脂多糖

Sievers^®Eclipse细菌内毒素检测仪（以下称Eclipse）采用动态显色法，用405 nm波长（即动态显色法的典型波长）来测量和分析内毒素的浓度。动态显色法使用带有显色基底的鲎试剂。显色基底是一种连接对硝基苯胺（pNA，一种黄色显色剂）的肽。如果样品中存在内毒素，鲎试剂中的酶促反应就会破坏连接pNA的肽键，从而在样品或溶液中释放黄色。可以用分光光度计来测量颜色变化，量化色变后可以得出内毒素浓度。Eclipse还可以使用Fujifilm Wako浊度试剂，也是用405nm波长来测量内毒素浓度。

Sievers Eclipse细菌内毒素检测仪

Eclipse检测仪由以下3部分组成：仪器、独特的微流控微孔板、软件。仪器是一台吸光度分析仪，具有37°C恒温培养控制和离心技术。微孔板内预置了细菌内毒素参考标准品（RSE，Reference Standard Endotoxin）和阳性产品对照（PPC，Positive Product Controls），允许用户在每次化验时运行最多5点标准曲线（浓度为50 - 0.005 EU/mL），以及最多21个样品及阴性和阳性对照。Eclipse软件操作简便，符合《联邦法规21章》第11款（21 CFR Part 11）的规定。

Sievers Eclipse细菌内毒素检测仪，最多减少90%的鲎试剂用量，也可使用重组级联试剂（rCR）

目的和范围

众所周知，鲎试剂（LAL）化验易受干扰。样品中可能含有抑制或增强内毒素检测的物质，因此产生假性结果。需要对待测样品进行方法适用性测试和抑制/增强测试，以确定克服上述干扰所需的稀释倍数（或其它有效方法）。

本文概述了如何进行抑制/增强测试，如何运行此测试来证明Sievers Eclipse细菌内毒素检测仪的适用性，以及提供运行样品的方法适用性。方法信息包括：所用的鲎试剂化验方法、化验灵敏度（λ）、验证的稀释倍数、PPC（阳性产品对照）加标浓度、稀释剂、%CV（变异系数）标准、以及平均PPC回收率。

样品信息包括：样品浓度（单位为mg/mL）、内毒素限值（EL，Endotoxin Limit；单位为 EU/mL）、最大有效稀释倍数（MVD，Maximum Valid Dilution）、最小有效浓度（MVC，Minimum Valid Concentration）、平均样品结果（单位为EU/mL）、以及样品储存/处理条件。

需要使用的物品和材料

Sievers Eclipse细菌内毒素检测仪，包括分析仪、微孔板、软件
鲎试剂（LAL）
细菌内毒素检查用水（LRW，LAL Reagent Water）
用于干扰测试的材料（如果需要）：

稀释用水（LRW），或生理盐水，或其它种稀释用液体
葡聚糖封闭缓冲液
加热块
缓冲液或pH调节试剂：Tris缓冲液、含镁缓冲液、HCl、NaOH
螯合剂：乙二胺四乙酸（EDTA），用于消除某些金属干扰
超滤装置
表面活性剂、非离子去垢剂或三乙胺

细菌内毒素工作标准品（CSE，Control Standard Endotoxin）或细菌内毒素参考标准品（RSE，Reference Standard Endotoxin）
不含内毒素的稀释管
不含内毒素的移液器吸头
可调量程移液器，可进行55 μL和1000 μL分液
血清移液器
不含内毒素的血清玻璃移液器
涡旋混合器

操作程序

抑制/增强研究：

应先进行初步的抑制/增强研究，以确定最佳稀释倍数，并评估可能存在的干扰。

根据待测样品总数、当前验证的稀释倍数、以及最大有效稀释倍数（MVD）/最小有效浓度（MVC），选择不同的稀释倍数。

所选稀释倍数应覆盖当前验证的稀释倍数之上和之下。

例如，如果当前验证的稀释倍数为1:500，则所选的稀释倍数应从1:1（未稀释）到1:2000，在此范围内评估实际最佳稀释倍数。如果样品没有当前验证的稀释倍数，则应从10倍稀释倍数开始选择，例如选择1:10、1:100、1:1000等。

所选的稀释倍数不可超过最大有效稀释倍数。但如果出于研究目的，所选的稀释倍数可以超过最大有效稀释倍数。

观察所有样品的PPC回收率和CV值，以确定适用于当前方法的最佳稀释倍数。PPC回收率必须在50 - 200%之间才能得到有效结果。

观察PPC回收率接近100%且不再随进一步稀释而提高时的稀释倍数，从而得出克服干扰所需的最佳稀释倍数。请注意，由于不同样品的干扰程度不同，因此无法使每个样品的加标回收率都达到100%
CV值应低于指定限值。如果没有指定限值，则CV值应低于10%。

如果稀释后始终无法实现最佳的PPC回收率，请评估是否存在干扰。

如果PPC回收率保持在50%以下，表示结果被抑制。
如果PPC回收率保持在200%以上，表示结果被增强。

如有需要，可以在最佳稀释倍数附近多选择几个稀释倍数来做进一步分析。

考虑所有因素之后，请进行以下部分的操作：

如果怀疑存在干扰，请进行下面的部分B“克服干扰”。
如果不存在干扰，请进行后面的部分C“加标测试”。

克服干扰：

干扰测试的要求根据样品性质而有所不同。鲎试剂化验要求有最佳和特定的活性条件，例如最佳的温度、pH值、离子强度。大多数药品配方适用于患者诊治，而非鲎试剂化验。因此大多数药品并不符合鲎试剂化验的最佳条件，会对鲎试剂化验有干扰。干扰表现为以下两种方式之一：抑制或增强。制药厂应当非常了解样品的化学组成，以便能够确定干扰源，这非常重要。可以参考“美国药典<1085>内毒素检测指南（USP <1085> Guidelines on Endotoxins Test）”，以了解常见的干扰及其缓解方法。下表是有关干扰摘要。

表 1. 常见干扰和缓解方法（摘自USP <1085>）

LPS：Lipopolysaccharide，脂多糖

BET：Bacterial Endotoxins Testing，细菌内毒素检测

在初始的抑制/增强研究中，如果PPC回收率持续偏低，且无法通过稀释来解决问题，请评估以下抑制因素来寻找缓解干扰的方法。

如果怀疑存在抑制干扰，干扰源可能是pH值、二价阳离子、螯合剂、蛋白质、塑料提取物、脂类/脂质体、重金属、渗透压、去垢剂、或钙离子。

应使用一份样品和一份鲎试剂来测量样品的pH值，这是因为鲎试剂通常有一定的缓冲力。可以通过稀释来调节pH值，包括直接用HCl或NaOH来调节样品，或者用Tris缓冲液作为稀释剂来调节样品。

1. pH值范围由鲎试剂生产商标定（通常为6-8）。
可以通过稀释或超滤来缓解二价阳离子的干扰。
通常可以通过稀释来缓解抑制螯合剂的干扰，也可以添加二价阳离子（例如MgCl₂）来缓解螯合剂的干扰。
可以通过稀释或热处理来缓解抑制性蛋白质的干扰。
可以添加三乙胺（TEA，0.05%）来缓解塑料提取物的干扰。
可以通过稀释、添加表面活性剂或非离子去垢剂来缓解脂类或溶酶体的干扰。还需从稀释用水（LRW）中提出脂类。
可以用水或含有1 mM EDTA的稀释剂进行稀释，以缓解重金属的干扰。
通常可以通过稀释来缓解渗透压的干扰。
通常可以通过稀释来缓解去垢剂的干扰。
可以用水或含有1 mM EDTA的稀释剂进行稀释，以缓解钙离子的干扰。

在初始的抑制/增强研究中，如果PPC回收率持续偏高，且无法通过稀释来解决问题，请评估以下增强因素来寻找缓解干扰的方法。

如果怀疑存在增强干扰，干扰源可能是螯合剂、蛋白质、醇/酚、β-葡聚糖、或其它丝氨酸蛋白酶。

通常可以通过稀释来缓解增强性螯合剂的干扰。
可以通过稀释或热处理来缓解增强性蛋白质的干扰。
通常可以通过稀释来缓解变性剂（如醇和酚）的干扰，也可以通过蒸发来缓解变性剂的干扰。
可以用葡聚糖封闭缓冲液来重构鲎试剂，以缓解β-葡聚糖的干扰。建议使用同一厂家生产的鲎试剂和β-葡聚糖封闭缓冲液。请按照鲎试剂和缓冲液随附的操作说明进行操作。可以通过稀释或热处理来缓解其它丝氨酸蛋白酶的干扰。

从初始干扰/增强研究的结果中，选择最佳的稀释倍数用于克服干扰的测试。

对于每个样品，建议采用多种稀释倍数来评估缓解干扰后的样品性能变化。
尽量多地利用微孔板上的21个样品孔来加载和测试样品和稀释倍数。

评估每个样品的PPC回收率和CV值，以确定在采取缓解干扰措施之后的最佳稀释倍数。

如果测试结果显示成功消除干扰，请进行下面的部分C“加标测试”。
如果未能消除干扰，请返回B.1或B.2部分，评估其它干扰源。

加标测试：

加标测试是可选程序，旨在进一步证明Sievers Eclipse适用于BET测试。此外还要求进行加标研究，以确定样品容器适用于测试样品。

根据之前的分析结果，为每个样品选择一个或多个最佳稀释倍数。

选择一个或多个加标浓度，证明Eclipse能够回收微孔板上的添加内毒素。

建议选择高于标准曲线中点的加标浓度（1 EU/mL或更高），以提高内毒素回收率。

按照生产商给的指导步骤来重构内毒素工作标准品（CSE）或内毒素参考标准品（RSE）。

将内毒素标准品用稀释用水（LRW）稀释至所需浓度。

留出足量的加标标准溶液，作为稀释液用于稀释样品。

用上述制备的加标溶液将样品稀释至最佳稀释倍数。

评估加标样品的原始内毒素浓度，以确定是否成功回收正确的加标浓度。

评估PPC回收率和CV值，以确认前面的最佳稀释倍数和缓解干扰方法的结果。

结论

对新产品进行细菌内毒素检测时，应执行以下程序：

初始的产品评估和稀释倍数优化

在对新产品进行内毒素检测之前，应先评估阳性产品对照（PPC）的回收率和变异系数（%CV），以检测样品基质所造成的干扰（包括抑制和增强）。此阶段的目标是确定最佳产品稀释倍数，从而将干扰降至可接受的范围之内。最佳稀释倍数应低于最大有效稀释倍数（MVD）。几乎所有产品都会干扰细菌内毒素检测（BET），因此了解产品基质非常重要。确定最佳稀释倍数之后，就可以进行产品验证。

产品验证程序：确保稳健性和合规性

产品验证包括以最佳稀释倍数测试3个不同批次的产品。这种多批次测试可以确保内毒素检测方法在测试不同批次产品时的一致性和稳定性，符合良好生产规范（GMP）和法规要求。

Sievers Eclipse细菌内毒素检测仪：高效便捷的解决方案

Sievers Eclipse细菌内毒素检测仪可以高效运行抑制/增强测试，以及上述3批次产品验证程序。此款检测仪采用先进的离心技术和动态方法，简化了内毒素检测流程。上述优点使得此款检测仪能够更快、更精确地报告检测结果，并提供准确的定量分析和干扰分析。

Sievers Eclipse检测仪的优点还包括：

高效：自动化功能减少了化验设置和移液的操作步骤，提高了通量。
直观：直观的用户界面简化了操作步骤，减少了错误，提高了数据质量。
合规性：此款检测仪满足有关药典测试和数据可靠性的严格法规要求

Sievers Eclipse细菌内毒素检测仪是细菌内毒素检测领域的一项重大的技术进步，为持续进行的产品验证需求提供了全面、高效、合规的解决方案，提高了产品的安全性和质量。

参考文献

National Library of Medicine. (2023). J. Oliveira and W.C. Reygaert. Gram-Negative Bacteria. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK538213/
Center for Disease Control. 2024. About Gram-negative Bacteria.

https://www.cdc.gov/gram-negative-bacteria/about/index.html

2024

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2025年8月15日 08:58

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